Генетические эффекты культивирования in vitro тканей кукурузы

geneticheskie-effekti-kultivirovaniya-kukuruziПо результатам молекулярно-генетического анализа каллюсных тканей инбредных линий кукурузы Black Mexican Sweet Corn С456, ВИР-27, ЧК-218, P346, а также сомаклональных линий, созданных на основе линии P346, оценены генетические эффекты культивирования in vitro тканей кукурузы. Установлено, что уже на ранних этапах культивирования происходят перестройки генома, проявляющиеся в полиморфизме продуктов RAPD-ПЦР. При этом часть обнаруженных изменений имела обратимый характер, что позволяет предполагать их взаимосвязь с процессами дедифференцировки клеток при индукции каллюсообразования.

Культивирование in vitro может вызывать дестабилизацию генома, отдаленные последствия которой проявляются в повышенной генетической изменчивости
потомства растений-регенерантов. В целом исследованные линии кукурузы характеризовались низким уровнем изменчивости в культуре тканей независимо от
типа эксплантата.
Кукуруза наряду с рисом и пшеницей является одной из наиболее важных зерновых культур, используемых как для производства продуктов питания, так и в качестве источника кормов для животноводства. В мировом земледелии она занимает первое место по площади посевов и второе (после пшеницы) — по валовому сбору зерна. Прогнозируется, что к 2020 г. мировые потребности в кукурузе вырастут на 50 % — до более 800 млн т в год и превысят потребление риса и пшеницы.
В Украине кукуруза является ценной продовольственной культурой. На протяжении многих лет для ее улучшения применяют традиционные методы селекции. Основными целями селекции в настоящее время являются повышение урожайности кукурузы и ее устойчивости к болезням и вредителям, приспособление растений к специфическим почвенно-климатическим условиям, разработка более эффективных методов селекции.
Поскольку эффективность селекции в значительной степени определяется размахом генетического разнообразия исходной выборки сортотипов растений, программы, направленные на получение высокоурожайных сортов с заданными характеристиками, требовали поиска и внедрения новых подходов, обеспечивающих увеличение генетической гетерогенности селекционного материала. Одним из таких подходов стало применение метода культуры клеток, тканей и органов растений, кото-
рый послужил основой для ряда биотехнологических разработок, в частности, генетического улучшения растений путем получения сомаклональных вариантов с новыми ценными качествами, биотрансформации, получения новых сортов с использованием созданных in vitro гаплоидов, удвоенных гаплоидов и др..

Культивирование в условиях in vitro представляет собой достаточно сильное стрессовое воздействие, следствием которого может быть генетическая изменчивость, получившая название сомаклональной. Изучение этого явления, с одной стороны, помимо собственно теоретического представляет также и практический интерес в связи с возможностью использования в селекционной практике, с другой — когда основной целью является микроклональное размножение или получение
генетически трансформированных растений, оно очевидно нежелательно и должно быть сведено к минимуму. В любом случае при использовании культуры тканей важно представлять себе частоту сомаклональной изменчивости, а также факторы, которые могут на нее влиять.

В данной работе мы обобщили результаты собственных исследований, проведенных с использованием нескольких инбредных линий кукурузы с целью оценки уровня сомаклональной изменчивости в культуре тканей кукурузы, а также возможных долговременных генетических эффектов культивирования в условиях in vitro.
Сомаклональная изменчивость в культуре тканей. В качестве источника эксплантатов для получения каллюсных культур, способных к регенерации, могут быть использованы различные меристематические ткани растения, однако считается, что наибольшей регенерационной способностью обладают каллюсы, происходящие из незрелых зародышей.
Нами проведен молекулярно-генетический анализ каллюсных культур кукурузы линии Black Mexican Sweet Corn С456 (в дальнейшем — С456), полученных из незрелых зародышей. Введение в культуру, методики выделения ДНК и RAPD-анализа подробно описаны. Изучением каллюсных культур возрастом 2, 3, 9 и 15 мес установлено, что основная масса изменений наблюдается уже после 2 мес культивирования. Генетические дистанции по Неи между двухмесячным каллюсом и исходным
растением, рассчитанные с использованием программы POPGENE 1.32, для линии С456 составили 0,0079. При дальнейшем выращивании in vitro наблюдали постепенное увеличение генетических дистанций культивируемых тканей от растения-донора эксплантатов, которые после 15 мес составили 0,0118.

Оценка уровня сомаклональной изменчивости каллюсных культур, полученных из незрелых зародышей, не дает возможности провести генетический анализ тканей эксплантата и предполагает использование в качестве контроля растений той же линии. В связи с этим возникает необходимость дополнительного молекулярно-генетического анализа внутрилинейной гетерогенности. Мы проанализировали 10 случайно отобранных растений линии С456. Полиморфизм RAPD-спектров под-
твердил наличие внутрилинейной гетерогенности. Вместе с тем вариабельность по полиморфным в культуре ампликонам не выявлена, вопрос о реальном уровне изменчивости в культуре тканей кукурузы линии С456 остался открытым.

Чтобы исключить возможный вклад внутрилинейной гетерогенности, были исследованы каллюсные ткани, полученные от индивидуальных растений инбредных линий кукурузы С456, Pioneer 346 (P346), ВИР-27 и ЧК-218 [3—5]. В качестве эксплантатов для получения таких культур использовали 1—2-суточные проростки, полученные проращиванием семян in vitro на питательной среде Мурасиге и Скуга с половинным содержанием солей. Оставшуюся часть проростка доращивали в течение 14 сут и выделяли из нее ДНК, которую использовали в качестве контроля. Это позволило оценить изменения, индуцированные культивированием in vitro, путем непосредственного сравнения ДНК каллюсной культуры и растения-донора ее эксплантата. Сравнительным изучением двух растений линии C456 и полученных
от них каллюсных тканей возрастом 4, 7, 12 мес методом RAPD-анализа с использованием 40 десятинуклеотидных праймеров обнаружено по 2 полиморфных ампликона из 275 учтенных (0,73 %) в каллюсах обоих растений. Генетические дистанции по Неи между каллюсными культурами и исходными растениями составили 0,0073.
При исследовании 6-месячных каллюсных тканей, полученных от восьми индивидуальных растений линии ВИР-27 и семи — линии ЧК-218, с применением 20 RAPD-праймеров из числа использованных для анализа каллюсных культур линии С456 выявлен один полиморфный фрагмент из 164 (0,61 %), который наблюдался в каллюсных тканях трех растений линии ВИР-27 (генетические дистанции по Неи составили 0,0061). Отличия между растениями и 6-месячными каллюсными куль-
турами для ЧК-218 не обнаружены.
RAPD-анализом двух растений линии P346 и полученных от них каллюсных культур возрастом 2 и 4 мес с применением 10 RAPD-праймеров выявлен один полиморфный ампликон из 77 (1,29 %) в каллюсной культуре одного из растений. Генетические дистанции между каллюсными культурами и исходными растениями составили от 0 до 0,0131.
Долговременные генетические эффекты культивирования in vitro. Помимо изучения непосредственного воздействия индукции каллюсообразования и последующего культивирования в условиях in vitro мы провели исследования, которые позволили оценить долговременные эффекты культивирования тканей in vitro на геном кукурузы. Материалом для этих исследований послужила инбредная линия кукурузы P346 и созданные на ее основе в Институте физиологии растений и генетики НАН Украины линии УКЧ-5, УКЧ-6, УКЧ-7, УКЧ-8, УКЧ-9, которые по сравнению с исходной P346 являются носителями ценных признаков, обладают повышенным регенерационным потенциалом. Основой для создания этих линий были сомаклональные варианты, процедура получения которых включала индукцию каллюсообразования из незрелых зародышей с последующим отбором из культивируемых тканей, характеризовавшихся спонтанной изменчивостью, клонов с фенотипическими признаками «индукция тотипотентного каллюсообразования» и «регенерационная способность». В ходе эксперимента, направленного на
изучение межлинейных отличий и внутрилинейного полиморфизма кукурузы линии P346 и ее сомаклонов, было проанализировано 9 растений линии P346, по 10 растений линий УКЧ-5, УКЧ-6, УКЧ-8 и УКЧ-9, 8 растений — УКЧ-7. RAPD-анализ проводили с применением 10 произвольных праймеров из числа использованных для других линий кукурузы. Для всех объектов учтено 89 ампликонов, 68 из которых принадлежали спектрам продуктов амплификации исходной линии P346, а остальные 21 — обнаруживали только у сомаклональных вариантов. Количество полиморфных ампликонов составило 42 (47,2 % общего числа ампликонов). Более подробно данное исследование описано в работе.

В ходе анализа спектров продуктов амплификации индивидуальных растений нами было выделено две группы полиморфных фрагментов. В первую из них вошли ампликоны (в количестве 20, или 22,5 %), характеризующиеся внутрилинейным полиморфизмом. При этом оказалось, что исследованные линии отличаются между собой по уровню генетической гетерогенности, в частности, по количеству растений с полиморфными спектрами и количеству вариабельных фрагментов. Наибольшая
гетерогенность была обнаружена у растений линий УКЧ-6 и УКЧ-8, наименьшая — у УКЧ-5. В то же время отличий в спектрах отдельных растений исходной инбредной линии P346 не наблюдали.
Во вторую группу вошли ампликоны (в количестве 22, или 24,7 %), которые характеризовались только межлинейным полиморфизмом и оставались стабильными в пределах выборки растений отдельных линий. Часть ампликонов из этой группы оказалась специфичной для определенных линий, тогда как другие обнаруживались у нескольких из них.
Исследованные линии отличались между собой по количеству фрагментов этой группы, а значит, и по генетическим дистанциям по Неи от исходной линии P346. Наибольшее количество полиморфных ампликонов из этой группы и наибольшие генетические дистанции от P346 были у линий УКЧ-6 и УКЧ-8 (соответственно 0,1542 и 0,1391), а наименьшие отличия — у УКЧ-5 (0,0131). Линии УКЧ-7 и УКЧ-9 практически не отличались между собой по генетической дистанции от P346 (0,0671 и
0,0811) и занимали промежуточное положение.

Для исследования генетической стабильности сомаклональных линий проведено изучение каллюсных тканей, полученных в результате их повторного введения в культуру in vitro. В качестве эксплантатов в этом эксперименте использовали ткани проростков семян индивидуальных растений. Всего проанализировано 19 растений и полученных от них каллюсных культур, в частности два растения линии P346; три —линии УКЧ-5; четыре — линии УКЧ-6; пять — линии УКЧ-7; три — линии УКЧ-8 и два — линии УКЧ-9. RAPD-ПЦР проводили с использованием тех же 10 праймеров, которые применяли для молекулярно-генетического анализа сомаклональных линий. Всего учтено 77 фрагментов, 6 из которых (7,7 % общего числа) были полиморфными.

Установлено, что сомаклональные линии отличались по уровню изменчивости в 2-месячной культуре тканей, в частности, по количеству
каллюсов, обладавших генетическими отличиями от исходных растений, а также обнаруженных у них полиморфных ампликонов. В каллюсных культурах линий УКЧ-7 и УКЧ-9 полиморфизм не наблюдался вообще.
В культуре тканей одного из двух растений линии P346 обнаружено отсутствие одного ампликона. Сходная по уровню изменчивость выявлена у сомаклональной линии УКЧ-5, в каллюсе одного из растений которой наблюдали дополнительный фрагмент, отсутствовавший в спектрах растения-донора эксплантата. В каллюсных культурах двух из трех растений линии УКЧ-8 обнаружено три полиморфных фрагмента. Наибольшим уровнем полиморфизма в культуре тканей in vitro характеризовалась линия УКЧ-6, в каллюсных тканях всех растений которой было от одного до трех вариабельных ампликонов.
При анализе тех же каллюсных культур 4-месячного возраста, направленном на изучение влияния длительности культивирования in vitro
на генетическую изменчивость, не обнаружено большинства отличий (9 из 15 проявлений полиморфизма), наблюдавшихся между растениями-донорами и 2-месячными каллюсами. Отличия от растений сохранились только у одной каллюсной культуры линии P346, двух — УКЧ-6 и двух —УКЧ-8, а общее количество полиморфных ампликонов снизилось до трех (3,9 % общего числа). Методом блот-гибридизации установлено, что гомологичные полиморфным ампликонам фрагменты есть и в RAPD-спектрах тех объектов, где они не выявлялись окраской бромистым этидием. Это позволяет предположить, что наблюдаемый полиморфизм вероятнее всего обусловлен значительными изменениями количества отдельных ПЦР-продуктов. Причинами таких количественных вариаций могут быть как нуклеотидные замены в участке гибридизации праймера, так и изменение количества амплифицируемой последовательности в составе матричной ДНК.

Обобщение. Первое сообщение об успешной регенерации полноценных растений из культуры тканей кукурузы было сделано в 1975 г.
Грином и Филлипсом. С того времени методики получения культивируемых тканей, способных к регенерации растений, а также питательные среды существенно усовершенствованы. Однако, несмотря на более чем 30-летнюю историю исследования культивируемых тканей кукурузы, количество публикаций, посвященных изучению сомаклональной изменчивости этого растения в культуре in vitro, весьма немногочисленно.
В частности установлено, что в каллюсных культурах и растениях-регенерантах кукурузы наблюдаются изменения нуклеотидной последовательности и количества копий некоторых генов. Данные об изменении характера метилирования ДНК под влиянием культивирования in vitro неоднозначны. Так, уровень метилирования мобильных элементов Mu оставался неизменным в эмбриогенных каллюсных культурах кукурузы линии А188 и полученных из них регенерантах. В то же время в растениях, регенерированных из 7-месячных эмбриогенных каллюсных культур, полученных из двух незрелых зародышей, обнаружены значительные вариации уровня метилирования ДНК ряда геномных последовательностей. В работах Осиповой и соавторов, изучавших сомаклональные варианты кукурузы линии А188, полученные из 2- и 8-месячных каллюсных культур с использованием RAPD- и ISSR-анализа, обнаружен высокий уровень генетического полиморфизма.
В качестве метода исследования сомаклональной изменчивости на ми выбран RAPD-ПЦР. Хотя этот подход предложен еще в 1990 г.
и с того времени появились другие более точные и эффективные методы молекулярно-генетического анализа, он по-прежнему находит применение для решения широкого круга задач. Основными достоинствами RAPD-анализа являются его относительная простота, дешевизна и быстрота проведения анализа, а также возможность получения большого количества молекулярных маркеров, случайным образом распределенных в геноме, с использованием небольшого количества матричной ДНК. Кроме того, этот метод не требует проведения предварительного анализа последовательности ДНК исследуемого генома. Показано, что в случае близкородственных или размножающихся клональным путем организмов RAPD-анализ по точности сопоставим с AFLP-ПЦР. К числу основных его недостатков относится то, что RAPD-маркеры подобно AFLP- и ISSR-маркерам являются доминантными, т.е. не позволяют отличать гомозиготу по доминантному аллелю от гетерозиготы. Среди недостатков RAPD-анализа часто упоминается и высокая чувствительность к условиям реакции ПЦР, однако тщательный их контроль обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов.

Исследованием каллюсных культур четырех линий кукурузы установлено, что выращивание в условиях in vitro приводит к возникнове-
нию перестроек генома, проявляющихся в виде полиморфизма продуктов RAPD-ПЦР. Все исследованные линии характеризовались низким уровнем изменчивости: полиморфизм отсутствовал вообще либо заключался в вариабельности единичных RAPD-ампликонов. Каллюсные культуры, полученные из незрелых зародышей или тканей проростков кукурузы, характеризовались примерно одинаковым уровнем изменчивости. Отличия от исходного растения наблюдали уже в 2-месячных культивируемых тканях. Дальнейшее выращивание in vitro сопровождалось возрастанием количества таких отличий, однако это происходило не во всех случаях.
При изучении сомаклональных линий обнаружены их генетические отличия от исходной инбредной линии P346, что также указывает на существование изменчивости в культуре тканей in vitro. Кроме того, в исследованных сомаклональных линиях наблюдали внутрилинейную гетерогенность. Растения каждой из сомаклональных линий являются прямыми потомками одного растения-регенеранта, полученными путем самоопыления, поэтому одним из источников такой гетерогенности могло стать расщепление признаков в потомстве гетерозиготной особи. Однако растения исходной линии были гомозиготными по изучавшимся локусам, что подтвердили результаты проведенного нами RAPD-анализа. В таком случае гетерозиготность растений-регенерантов свидетельствует о том,
что в культуре тканей in vitro произошли мутации, которые привели к возникновению разных аллельных форм части геномных локусов. Не исключено также, что под влиянием культивирования in vitro произошла дестабилизация генома, отдаленные последствия которой проявились у потомков растения-регенеранта. Однако имеющиеся у нас данные не позволяют сделать однозначного вывода о реализации какого-либо конкретного механизма. Существование другой группы полиморфных фрагментов, не характеризовавшихся внутрилинейной вариабельностью, но отличавшей сомаклональные линии от исходного генотипа, свидетельствует о возможности возникновения мутаций в гомозиготной форме или об их отборе при дальнейшем размножении.

В числе особенностей, обнаруженных в результате анализа линии P346 и полученных от нее сомаклональных линий, следует отметить взаимосвязь между отличиями от исходной линии, уровнем внутрилинейной гетерогенности и сомаклональной изменчивости. Так, наиболее удаленные от P346 сомаклональные линии имеют наивысший уровень внутрилинейного полиморфизма и изменчивости в культуре in vitro, и наоборот, линии с наименьшей генетической дистанцией от P346 характеризуются наименьшей внутрилинейной генетической гетерогенностью и низким уровнем изменчивости культивируемых тканей. Взаимосвязь между генетической удаленностью от исходной линии и внутрилинейной гетерогенностью можно объяснить тем, что изменения, возникающие в культуре in vitro, приводят к переходу генных локусов в гетерозиготное состояние: чем большим изменениям подвергается геном, тем больше локусов становятся гетерозиготными и тем выше гетерогенность среди семенных потомков растения-регенеранта. Вместе с тем культивирование
in vitro может быть причиной дестабилизации генома, отдаленные последствия которой могут проявляться в повышенной изменчивости растений сомаклональных линий. В пользу такого предположения свидетельствует и повышенная изменчивость растений этих линий в культуре тканей.

Полученные данные показывают, что величина генетических отличий от исходного растения у сомаклональных линий, полученных из растений-регенерантов, может существенно отличаться от таковой у культивируемых тканей. Так, в случае линии P346 генетические дистанции каллюсных культур от исходного растения варьировали от 0 до 0,0131.
Для сомаклональных линий значение этого показателя составляло от 0,0131 до 0,1542. Данные многочисленных цитологических исследований, в том числе и кукурузы, свидетельствуют о том, что культивируемые ткани растений представляют собой гетерогенную клеточную популяцию. RAPD-анализ ДНК культивируемых тканей не дает возможности охарактеризовать всю эту гетерогенность, а выявляет главным образом лишь генетические маркеры, присущие клеткам, представляющим значительную часть популяции. В то же время растения-регенеранты несут в себе генетическую информацию отдельных клеток, которые дали им начало. Поэтому молекулярно-генетический анализ культивируемых тканей позволяет лишь приблизительно прогнозировать генетические изменения в растениях-регенерантах.
Еще одной особенностью обнаруженных в культивируемых тканях генетических изменений является то, что значительная часть амплико-
нов характеризуется вариабельностью по количеству. Как уже отмечалось, причинами количественного полиморфизма может служить как изменение количества амплифицируемой последовательности в составе матричной ДНК, которое, в свою очередь, может быть обусловлено вариабельностью ее копийности в геномах культивируемых клеток, так и колебания соотношения различных типов клеток в составе клеточной популяции. Для возникновения обнаруженных нами генетических изменений потребовался небольшой интервал времени (1—2 мес), и это позволяет предполагать, что они происходили одновременно в значительной части популяции культивируемых клеток. Такие упорядоченные перестройки генетического материала, на наш взгляд, возможны только в том случае, если они являются запрограммированным ответом клетки на внешнее воздействие, т.е. ассоциированы с определенными изменениями физиологического состояния клетки. В качестве примера таких событий можно назвать процессы дедифференцировки клеток при индукции каллюсоообразования и их последующей дифференцировки при воздействии определенными фитогормонами. Таким образом, часть об-
наруженных нами в культуре тканей кукурузы изменений может быть отнесена к эпигенетическим. В пользу этого предположения свидетельствует однотипность изменений в каллюсных культурах, полученных от растений одной или даже разных линий, а также наблюдаемая в некоторых случаях их обратимость.

Подводя итоги, можно сделать следующие заключения. Выращивание тканей кукурузы в условиях in vitro приводит к возникновению перестроек генома уже на ранних этапах культивирования, проявляющихся в виде полиморфизма продуктов RAPD-ПЦР. Каллюсные ткани четырех исследованных линий кукурузы характеризовались низким уровнем изменчивости. Существенных отличий в уровне изменчивости каллюсных культур, полученных с использованием различных типов эксплантатов, а именно незрелых зародышей и тканей проростков, не наблюдалось.
Обнаруживаемый в культивируемых in vitro тканях кукурузы генетический полиморфизм может быть реализован в виде более широкого диапазона изменчивости в растениях-регенерантах. Культивирование in vitro способно вызывать дестабилизацию генома, отдаленные последствия которой проявляются в повышенной генетической изменчивости потомства растений-регенерантов.